開展棉花體細胞胚胎發生的研究工作, 對于拓寬棉花種質資源和培育棉花品種具有重要意義。迄今關于棉花體細胞胚胎發生分子機制的研究僅見少量報道。近年來, 在擬南芥和其它植物組織的研究中已經證實了蛋白質組學是研究植物發育分子機制的有力工具, 目前已在棉花纖維發育、胚珠突變體等的研究中應用, 但在棉花體細胞胚胎發生上尚未見報道。蛋白質雙向電泳是蛋白質組學研究中蛋白質分離的主要手段。然而, 雙向電泳所涉及的環節較多, 尤其是棉花胚性培養物中含有大量的色素、多酚、醌、脂及其它多種次生代謝產物, 用常規方法不易去除干凈, 對等電聚焦、SDS-PAGE 和凝膠染色的干擾較大, 影響了蛋白質的分離效果。基于此,本文以陸地棉Coker 201 胚性愈傷組織為材料,對蛋白質樣品的制備方法進行了探討, 初步建立了以棉花胚性培養物為研究對象的蛋白質雙向電泳技術體系。
1 材料和方法
1. 1 供試材料及處理
陸地棉材料Co ker 201 的成熟種子經去殼消毒后, 種植在1/ 2MS 培養基上, 于( 28±1)℃下暗培養7 d 左右, 獲無菌苗。取無菌苗下胚軸切成0. 5 cm 左右的小段, 平放于愈傷誘導培養基( MS無機鹽, B5 有機物, 0. 45 Lmo l.L-1 2, 4-D, 0. 46Lmol. L-1 KT, 0. 1% (W/ V ) MgCl2. 6H2 O, 3%(W/ V) glucose) 上。誘導35 d 左右將愈傷組織轉移到2, 4-D減半的愈傷誘導培養基上繼代培養。以后每28 d 繼代1次, 直至愈傷組織發生胚分化。把胚性愈傷組織轉入分化培養基( MS 無機鹽( 無NH4NO3 而KNO3 加倍) , B5 有機物,2. 46 Lmo l.L-1 IBA, 0. 70 Lmol.L-1 KT, 0. 1%(W/ V) Glu, 0. 1% ( W/ V) Asn, 3% ( W/ V ) glucose), 每28 d 繼代1 次。愈傷的誘導和分化培養于28 ℃, 光照強度( 冷光源) 135 Lmol.m-2 .s-1 , 每天光照14h的條件下進行。所獲得的胚性愈傷組織用于蛋白質的提取。
1. 2 化學試劑
尿素、硫脲、十二烷基磺酸鈉( SDS) 均購自Sigma 公司, 二硫蘇糖醇( DT T) 、3-[ ( 3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸( CHAPS)、I PG 緩沖液、標準蛋白質和線性IPG 膠條( pH 3~ 10, 長7 cm)均購自Bio-Rad 公司, 其余試劑為產分析純產品。所有溶液均用超純水配制。
1. 3 蛋白質的提取
比較了4 種蛋白質提取方法。各方法均稱取0. 1 g 胚性愈傷組織, 加入0. 01 g PVPP, 用液氮研磨成粉, 并轉入離心管中。
方法A: 參照Fer guson 和T urley的方法稍有改動。向胚性愈傷粉末中加入0. 5 mL 冷提取液( 500 mmol.L-1 T ris-HCl, pH 8. 65, 50mmo l.L-1 EDTA, 100 mmol.L-1 KCl, 2% ( V/V)B-巰基乙醇) 和0. 5 mL T ris-HCl 飽和酚( pH7. 9)中, 勻漿1 min, 然后于4℃ , 12000 @ g 離心10 min。收集界面和酚相, 加入0. 5 mL 冷提取液, 勻漿1 min, 4℃ , 12000 @ g 離心10 min, 重復3 次。收集后1 次萃取的界面和酚相, 加入5 倍以上體積的含0. 1 mo l.L-1 醋酸銨的冷甲醇, 混勻并于-20℃ 過夜。4℃ , 12000 @ g 離心10 min 后將沉淀用含0. 1 mo l. L-1醋酸銨的冷甲醇洗2 次, 80% 冷丙酮洗2 次。4℃真空干燥后,-80℃密封保存備用。
方法B: 先采用Yao 等的方法, 將胚性愈傷粉末完全懸浮于1 mL 冷丙酮中, 勻漿1 min 后于4℃, 12000 @ g 離心5 min。棄上清, 沉淀用1 mL 預冷丙酮再洗1 次。將得到的沉淀凍干30min, 然后采用方法A 所述的酚抽提法提取蛋白。方法C: 先按方法B, 將胚性愈傷粉末用1mL 冷丙酮洗2 次。再參照Wang 等的方法,將沉淀重懸浮于1 mL 含10% TCA 的預冷丙酮中, 徹底渦旋1 min 后, 于4℃, 12000 @ g 離心5min。棄上清, 將沉淀重懸浮于含0. 1 mol . L-1醋酸銨的80% 預冷甲醇中, 充分混勻后于4℃,12000 @ g 離心5 min。將得到的沉淀用80%預冷丙酮洗滌1 次后凍干30 min, 然后采用方法A所述的酚抽提法提取蛋白。
方法D: 先參照Wang 等的方法, 將胚性愈傷粉末用1 mL冷丙酮洗2 次后, 再用1 mL 含10% T CA 的預冷丙酮洗4次, 用1 mL 10%TCA 溶液洗2次, 用1 mL 80% 冷丙酮洗2次。將得到的沉淀凍干30 min, 然后采用方法A 所述的酚抽提法提取蛋白。
1. 4 蛋白質的溶解
利用提取方法C 所提取的蛋白質比較了3種有代表性的裂解液對樣品的溶解效果。裂解液A 為8 mol. L-1 尿素, 2% (W/ V ) CHAPS, 0. 3%(W/ V) DTT , 0. 5% ( W/ V ) IPG buf fer( pH 3~10) ; 裂解液B 為9. 5 mol.L-1 尿素, 2% (W/V) CHAPS, 1% ( W/ V) DTT , 0. 8%( W/ V) IPGbuffer( pH 3~ 10); 裂解液C 為7 mo l. L-1尿素, 2 mol. L-1 硫脲, 4% ( W/ V ) CHAPS, 1%(W/ V) DT T, 0. 2% ( W/ V ) IPG buf fer ( pH 3~10)。不同提取方法的SDS-PAGE 和2-DE比較采用裂解液C 溶解蛋白質。各蛋白質樣品用130 LL 裂解液溶解, 室溫下, 反復渦旋和浸泡1 h, 使蛋白充分溶解。然后室溫20000 @ g, 離心20 min。收集上清, 17℃ , 14000 @ g 再次離心20 min。上清液即為蛋白質溶液, 用于2-DE分析或SDS-PAGE 分析。用改良的Bradford法分析蛋白濃度, 以牛血清蛋白( BSA) 繪制標準曲線定量蛋白。
1. 5 SDS-聚丙烯酰胺電泳( SDS-PAGE)
采用Laemmli 的方法在垂直板電泳槽上進行電泳。濃縮膠濃度為4. 5%, 分離膠濃度為12% , 凝膠板厚為1mm。上樣前, 將蛋白質樣品溶液按1 B1 ( V/ V )的比例加入2 @ 上樣緩沖液( 125 mmol.L-1 T ris-HCl, pH 6. 8, 4% SDS, 20%甘油, 100 mmol.L-1DT T, 0. 1% 溴酚藍) , 37℃ 保溫6 h。每泳道上樣體積15LL。室溫下, 先恒壓50 V 電泳1 h, 然后恒壓150 V 電泳直到溴酚藍到達分離膠底部邊緣。各樣品制備和SDS- PAGE 重復3 次。
1. 6 雙向電泳
選用7 cm IPG 膠條( pH 3~ 10, NL) , 各樣品補加溴酚藍( 終濃度0. 001%) 后, 取125 LL 上樣。20 e 下, 將膠條水化12 h, 接著在水平電泳儀( 北京六儀器廠) 中等電聚焦, 程序如下: 250 V, 30 min; 500 V, 30 min; 4000 V, 3 h; 后穩定在4000 V 下進行直至達到20 kV h。每根膠條限流50 LA。聚焦完成后, 將聚焦好的膠條依次在含有2% ( W/ V ) DTT 和2. 5% ( W/ V) 碘乙酰胺的平衡液( 6 mmol. L-1 尿素, 2% SDS,375 mmol.L-1 T ris-H Cl pH 8. 8, 20% 甘油) 中各平衡15 min。然后將膠條放置于垂直的12%的自制凝膠的端, 加入分子質量標準蛋白, 用封膠瓊脂糖封固膠條后進行SDS- PAGE 電泳。各樣品制備和2-DE 重復3 次。
1. 7 染色和圖像掃描
電泳結束后采用Blue silver 法染色。用UMAX Aust ra 5400 掃描凝膠。
